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    • 专利摘要:
    本發明包括如下步驟：第1步驟，其係準備含有醣鏈之溶液；第2步驟，其係使溶液接觸與醣鏈特異性結合之捕捉載體，而獲得具有結合於捕捉載體上之醣鏈及除所結合之醣鏈以外之物質的捕捉載體；第3步驟，其係自捕捉載體除去物質；第4步驟，其係使結合於捕捉載體上之醣鏈自捕捉載體再游離後，利用標記化試劑將再游離之醣鏈標記化；及第5步驟，其係將經標記化之醣鏈與捕捉載體分離而純化；並且，於第3步驟中，使用具有複數個具備過濾器之孔的多孔過濾板，向收納有具有醣鏈及物質之捕捉載體的多孔過濾板之各孔內供給自捕捉載體除去物質之清洗液後，使各孔之上下產生壓力差，藉此利用各過濾器將清洗液與捕捉載體分離。藉此，可以簡單之操作且大量地以優異之精度分離純化醣鏈。
    公开号:TW201321397A
    申请号:TW101136138
    申请日:2012-09-28
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Midori Sakaguchi；Hideyuki Shimaoka
    申请人:Sumitomo Bakelite Co；
    IPC主号:C13B20-00
    专利说明:
    醣鏈之純化方法
    本發明係關於一種醣蛋白所具有之醣鏈之純化方法。
    所謂醣鏈，係葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖(fucose)、木糖、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、唾液酸等單醣及該等之衍生物藉由醣苷鍵而複數鍵結成鏈狀之分子的統稱。
    醣鏈極富多樣性，係與天然存在之生物所具有之各種功能相關的物質。醣鏈於生物體內多以結合於蛋白質或脂質等上之複合醣質之形式存在，為生物體內之重要構成成分之一。業界逐漸明瞭生物體內之醣鏈與細胞間訊息傳遞、蛋白質之功能或相互作用之調整等深度相關。
    作為具有醣鏈之生物體高分子，例如可列舉：有助於細胞之穩定化的植物細胞之細胞壁之蛋白多醣，對細胞之分化、細胞之增殖、細胞之黏著、細胞之移動等產生影響的醣脂質(glycolipid)，及與細胞間相互作用或細胞識別相關之醣蛋白等。業界逐漸明瞭該等高分子之醣鏈一面相互代行、輔助、擴增、調節、或抑制功能一面高度控制精密之生物體反應的機制。進而，若上述醣鏈與細胞之分化增殖、細胞黏著、免疫、及細胞之癌化的關係獲得明確，則可期待使該醣鏈工程學與醫學、細胞工程學、或臟器工程學密切關連而謀求新發展(非專利文獻1)。
    已知尤其是存在於細胞表面之醣鏈作為各種生物體反應之基礎而發揮重要作用。例如據稱醣鏈和由與受體之相互作用異常引起之疾病之產生、或艾滋病毒或流感病毒等之感染、病原性大腸菌O157之毒素或霍亂毒素向細胞內之侵入有關。又，於某種癌細胞中，於細胞表面出現特異性之醣鏈。如此，認為細胞表面之醣鏈係對細胞賦予個性之重要分子。
    為了對該等疾病之產生等進行解析，業界正開發醣鏈結構解析技術。該等技術係組合自複合醣質切割出醣鏈、醣鏈之分離純化、醣鏈之標記化等步驟者。然而，該等步驟極其煩雜。
    進而，關於醣鏈之分離純化，例如採用使用離子交換樹脂之方法、逆相層析法、使用活性碳之方法、凝膠過濾層析法等方法。然而，該等分離方法並非特異性地識別醣之方法，因此於所分離出之醣鏈中會不可避免地混入夾雜物(肽、蛋白質等)。又，根據醣鏈之結構，醣鏈之回收率多產生差異。
    又，於利用層析法高精度地分離醣鏈之情形時，需對醣鏈實施吡啶胺基化等螢光標記，需要煩雜之操作。並且，於對經螢光標記之醣鏈進行分析時，需自標記後之反應液中除去未反應之2-胺基吡啶等夾雜物，對該標記化醣鏈進行純化。
    一般而言，利用標記化醣鏈與夾雜物之分子量之差異而進行凝膠過濾，自標記化醣鏈中除去夾雜物。然而，該方法需使用大量器具、且操作需要大量時間，就該等方面而言難以於短時間內處理大量試樣。
    又，作為簡易之方法，亦嘗試藉由共沸自標記化醣鏈中蒸餾去除夾雜物之方法，但難以充分地除去夾雜物。
    進而，為了調查醣鏈結構與各種疾患之關係，需研究大量樣本之醣鏈結構，以可進行該關係之統計處理。
    於如上所述之先前法中，為了分離醣鏈，需經過煩雜之步驟，需要巨大之成本與時間。因此，業界謀求一種以簡單之操作且大量地以優異之精度分離純化醣鏈的手段。
    進而，關於對醣鏈實施螢光標記之方法，進行有各種開發(例如專利文獻1、2、3)。然而，該標記化效率並非100%，於1個試樣中混合存在經標記之醣鏈與未經標記之醣鏈。該狀況於使用高效液相層析法(HPLC，High Performance Liquid Chromatography)、或毛細管電泳法(CE(Capillary Electrophoresis)法)對醣鏈進行螢光檢測時並非大問題。然而，於藉由質譜法對醣鏈進行分析時，存在使質譜圖(mass spectrometry)或質量色譜圖(mass chromatogram)之波峰變得複雜之問題。又，於對醣鏈之標記化效率較差之情形時，即便藉由HPLC或CE進行分析，亦可能產生檢測醣鏈之感度下降之問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]日本專利特開平7-20131號公報
    [專利文獻2]日本專利特開2006-098367號公報
    [專利文獻3]日本專利特開2008-309501號公報 所非專利文獻]
    [非專利文獻1]醣鏈生物學入門 化學同人2005年11月1日發行 第1版
    本發明之目的在於提供一種可以簡單之操作且大量地以優異之精度對多樣本同時分離純化醣鏈的醣鏈之純化方法。
    上述目的係藉由下述(1)~(12)之本發明而達成。
    (1)一種醣鏈之純化方法，其特徵在於包括如下步驟：第1步驟，其係準備含有醣鏈之溶液；第2步驟，其係使上述溶液接觸與上述醣鏈特異性結合之捕捉載體，而獲得具有結合於捕捉載體上之上述醣鏈及除該結合之醣鏈以外之物質的上述捕捉載體；第3步驟，其係自上述捕捉載體除去上述物質；第4步驟，其係使結合於上述捕捉載體上之上述醣鏈自上述捕捉載體再游離後，利用標記化試劑將該再游離之醣鏈標記化；及第5步驟，其係將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離而純化；並且於上述第3步驟中，使用具有複數個具備過濾器之孔的多孔過濾板，向收納有具有上述醣鏈及上述物質之上述捕捉載體的上述多孔過濾板之上述各孔內供給自上述捕捉載體除去上述物質之清洗液後，使上述各孔之上下產生壓力差，藉此利用上述各過濾器將上述清洗液與上述捕捉載體分離。
    (2)如上述(1)之醣鏈之純化方法，其中於上述第3步驟中，使上述各過濾器之下側成為負壓，藉此使上述清洗液透過至上述各過濾器之下側。
    (3)如上述(1)之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使用上述多孔過濾板，使收納有上述捕捉載體及上述經標記化之醣鏈的上述多孔過濾板之上述各孔之上下產生壓力差，藉此利用上述各過濾器將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離。
    (4)如上述(3)之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使上述各過濾器之下側成為負壓，藉此使上述經標記化之醣鏈透過至上述各過濾器之下側。
    (5)如上述(4)之醣鏈之純化方法，其中於上述多孔過濾板之下側配置具有複數個孔之微孔板，向與上述多孔過濾板之上述各孔對應之上述微孔板之上述各孔內選擇性地供給上述經標記化之醣鏈。
    (6)如上述(5)之醣鏈之純化方法，其中上述多孔過濾板之底面與上述微孔板之上表面的間距為10 mm以下。
    (7)如上述(1)之醣鏈之純化方法，其中上述標記化試劑為由芳香族胺所構成之螢光物質。
    (8)如上述(7)之醣鏈之純化方法，其中上述螢光物質係選自2-胺基苯甲醯胺、2-胺基苯甲酸、8-胺基芘-1,3,6-三磺酸鹽、8-胺基萘-1,3,6-三磺酸鹽、2-胺基-9(10H)-吖啶酮、5-胺基螢光素、丹磺醯乙二胺、7-胺基-4-甲基香豆素、3-胺基苯甲酸、7-胺基-1-萘酚、3-(乙醯胺基)-6-胺基吖啶中之至少1種。
    (9)如上述(7)之醣鏈之純化方法，其中於上述第4步驟中，上述再游離之醣鏈藉由上述標記化試劑之標記化係於至少包含上述再游離之醣鏈及上述螢光物質之溶液中進行，並且該溶液中之上述螢光物質之濃度為0.5 mol/L以上。
    (10)如上述(1)之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離後，進而使上述經標記化之醣鏈自未被用於標記化之上述標記化試劑分離。
    (11)如上述(10)之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使用具有複數個具備矽膠之孔的多孔矽膠板，於該多孔矽膠板之上述各孔內，基於上述經標記化之醣鏈於上述矽膠上之吸附力與上述標記化試劑於上述矽膠上之吸附力的差異，使上述經標記化之醣鏈自未被用於標記化之上述標記化試劑分離。
    (12)如上述(1)之醣鏈之純化方法，其中上述捕捉載體為具有醯肼基或氧基胺基之聚合物粒子。
    根據本發明，可以簡單之操作且以優異之精度分離純化醣鏈。進而，由於可一併對供給至複數個孔內之處理液進行處理，故而可藉由一次之純化處理對大量(複數種)醣鏈進行純化。
    以下，基於較佳之實施形態詳細說明本發明之醣鏈之純化方法。
    再者，以下，於說明本發明之醣鏈之純化方法之前，首先對醣蛋白所具有之醣鏈之純化方法(本發明之醣鏈之純化方法)所使用之純化裝置之一例進行說明。 <純化裝置>
    圖1係表示本發明之醣鏈之純化方法所使用之純化裝置之一例的分解立體圖，圖2係表示本發明之醣鏈之純化方法所使用之純化裝置之一例的立體圖，圖3係圖2所示之純化裝置之A-A線剖面圖(再者，圖3(a)係表示於純化裝置上安裝有微孔板之情形，圖3(b)係表示於純化裝置上安裝有塔板之情形)。再者，於以下之說明中，為了便於說明，將圖1~圖5中之上側稱為「上」、下側稱為「下」。
    圖1~圖3所示之純化裝置1具有多孔過濾板100、支撐該多孔過濾板100之第1支撐台400、微孔板200、塔板300、及支撐該等微孔板200或塔板300之第2支撐台500。
    多孔過濾板100之整體形狀呈平板狀，具備設置於其厚度方向(上下方向)上之複數個(於本實施形態中為96個)孔(孔部)101。
    如圖3所示，該等孔101分別於其下側具備底部103，進而對應於該底部103之大致中心位置而設置有貫通該底部103之貫通孔104。藉此，可使供給(收納)至孔101內之液體經由該貫通孔104自底部103向孔101之外部流出。
    貫通孔104之孔徑較佳為設定為0.1 mm~1 mm左右，更佳為設定為0.2 mm~0.7 mm左右。
    進而，於孔101之下側(底部103側)以堵塞貫通孔104之方式配置有過濾器105。藉由該過濾器105與貫通孔104之孔徑之關係，於靜置多孔過濾板100時，抑制供給至孔101內之液體經由貫通孔104向孔101之外部流出(受到阻擋)。
    相對於此，如下所述，於將多孔過濾板100安裝於純化裝置1上，使用抽吸泵對第2支撐台500所具有之凹部505內進行抽吸時，容許上述液體透過(通過)過濾器105。因此，上述液體經由貫通孔104自底部103側向孔101之外部流出。
    作為過濾器105之原材料，並無特別限定，例如可列舉多孔性膜及不織布等。又，作為其構成材料，可列舉：聚四氟乙烯、纖維素酯、偏二氟乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯及尼龍等，可使用該等中之1種或組合2種以上使用。
    再者，較佳為對該過濾器105實施親水處理。藉此可實現上述液體之透過性之提高。
    該親水處理例如可藉由對過濾器105賦予(塗佈等)界面活性劑、水溶性矽、聚丙二醇等而進行。
    過濾器105所具備之細孔之孔徑較佳為設定為0.1~50 μm左右，更佳為設定為0.2~20 μm左右，進而較佳為設定為0.4~10 μm。藉此，容許上述液體所含之液態成分之透過，同時確實地禁止如下所述之聚合物粒子20之透過(受到阻擋)。
    再者，作為多孔過濾板100之除過濾器105以外之各部之構成材料，並無特別限定，例如可列舉：聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE，Polytetrafluorethylene)等，可使用該等中之1種或組合2種以上使用。其中，作為其構成材料，較佳為聚丙烯、氯乙烯、PTFE等。藉此，可提高多孔過濾板100之耐溶劑性或耐熱性。
    第1支撐台400係用以支撐多孔過濾板100之構件。該第1支撐台400呈平板狀，具有具備中央部開口之開口部402之底部401、以沿著底部401之外緣向上方突出之方式設置之上側外壁403、及以沿著底部401之外緣向下方突出之方式設置之下側外壁404。
    藉由利用上述上側外壁403進行包圍而於其內側形成凹部405。於該凹部405內插入多孔過濾板100，藉此由第1支撐台400支撐多孔過濾板100。
    又，沿著底部401之開口部402之邊緣部設置有溝槽。以對應於該溝槽之方式配置有墊圈(密封構件)407。藉此，於向凹部405內插入多孔過濾板100時，禁止開口部402與純化裝置1之外部之連通(被阻斷)。
    再者，上側外壁403於對向之2個長邊之中央部之與厚度方向(上下方向)正交之方向上具有開口部408。藉此，可容易地進行插入(載置)至凹部405內之多孔過濾板100之出入。又，於將多孔過濾板100插入凹部405內時其上端部自凹部405突出的情形時，可省略開口部408之形成。
    進而，藉由利用下側外壁404進行包圍而於其內側形成凹部406。沿著該凹部406之內周面插入下述第2支撐台500所具有之突出部502，藉此將第1支撐台400固定於第2支撐台500上。
    再者，於本實施形態中，藉由一體地形成上側外壁403之外周面與下側外壁404之外周面，而由1個平坦面構成該等。
    再者，作為第1支撐台400之構成材料，並無特別限定，例如可列舉：如聚碳酸酯、丙烯酸系樹脂、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS樹脂)之樹脂材料，如不鏽鋼等Fe系合金、Cu或Cu系合金、Al或Al系合金之金屬系材料，如氧化鋁、磷灰石、氮化鋁之陶瓷系材料等，可使用該等中之1種或組合2種以上使用。
    微孔板200係用於插入第2支撐台500所具備之凹部505內者。
    該微孔板200與多孔過濾板100同樣地，其整體形狀呈平板狀，具備設置於其厚度方向(上下方向)上之複數個(於本實施形態中為96個)孔(孔部)201。
    該等孔201分別於其下側具備底部203，於該底部203側不貫通。藉此，將供給(收納)至孔201內之液體儲留於其內部。
    再者，多孔過濾板100所具備之各孔101、與微孔板200所具備之各孔201係以於使板100、200彼此沿上下方向重合時分別沿上下方向對應地配置之方式進行設定。因此，如以下所詳述般，通過各孔101所具備之貫通孔104自底部103側向多孔過濾板100之外部流出之液體係選擇性地供給至以與各孔101對應之方式配置之各孔201內。
    又，微孔板200具有形成有複數個孔201之孔形成部202、與以包圍該孔形成部202之周圍之方式配置之框部204。孔形成部202之厚度厚於框部204。藉此，孔形成部202之上表面自框部204之上表面突出。
    該孔形成部202之俯視形狀係設定為可插入第1支撐台400之開口部402內之大小。因此，於第2支撐台500之凹部505內配置有微孔板200之狀態下，若於第2支撐台500上載置第1支撐台400，則如圖3(a)所示，可將孔形成部202插入至開口部402內。
    因此，可將孔形成部202之上表面、與多孔過濾板100之底面(底部103之下表面)的間距設定為較小。基於上述情況，可將自多孔過濾板100之孔101經由貫通孔104流出之液體高效率地供給至與該孔101對應之微孔板200之孔201內。
    再者，作為微孔板200之構成材料，例如可列舉與作為多孔過濾板100之除過濾器105以外之各部之構成材料所列舉者相同的構成材料。
    塔板300與微孔板200同樣地係用於插入第2支撐台500所具備之凹部505內者。即，根據藉由使用純化裝置1之醣鏈之純化方法所實施之處理之種類，將塔板300或微孔板200插入至凹部505內。
    該塔板300於與形成有複數個孔201之孔形成部202對應之位置具備1個凹部301，除此以外，成為與上述微孔板200相同之構成。
    藉由將塔板300設為具備上述凹部301之構成，如圖3(b)所示，於第2支撐台500之凹部505內配置有塔板300之狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400時，可將自多孔過濾板100之各孔101經由貫通孔104流出之液體一併儲留於塔板300之凹部301內。
    再者，如圖1等所示，塔板300於與微孔板200之框部204對應之位置具有突出之凸部。然而，塔板300並不限於該構成，只要於其中心部側形成有凹部301，則亦可省略凸部之形成。
    再者，作為塔板300之構成材料，例如可列舉與作為多孔過濾板100之除過濾器105以外之各部之構成材料所列舉者相同的構成材料。
    調整板600係用以於塔板300或微孔板200之前插入至第2支撐台500所具備之凹部505內者。
    該調整板600呈平板狀，準備有複數片厚度不同者。
    並且，根據插入凹部505內之微孔板200之種類，選擇適當之厚度者，藉此可容易地將微孔板200(孔形成部202)之上表面、與多孔過濾板100之底面(底部103之下表面)的間距設定為較小。
    再者，作為調整板600之構成材料，例如可列舉與作為多孔過濾板100之除過濾器105以外之各部之構成材料所列舉者相同的構成材料。
    第2支撐台500係用以支撐微孔板200或塔板300之構件，具有呈平板狀之底部501、與以沿著底部501之外緣向上方突出之方式設置之外壁503。
    藉由利用上述外壁503進行包圍而於其內側形成凹部505。於該凹部505內插入微孔板200或塔板300，藉此由第2支撐台500支撐微孔板200或塔板300。
    又，外壁503具有沿著外壁503之內緣向上方突出之突出部502。該突出部502係以可沿著第1支撐台400所具備之凹部406之內周面插入的方式進行設定。藉此，於第2支撐台500上載置第1支撐台400時，藉由將突出部502插入至第1支撐台400之凹部406內，而將第1支撐台400固定於第2支撐台500上。
    於外壁503之上表面，以包圍突出部502之方式設置有溝槽。以對應於該溝槽之方式配置有墊圈(密封構件)507。藉此，於第2支撐台500上載置第1支撐台400時，禁止於支撐台400、500彼此間之與外部之連通(被阻斷)。
    進而，外壁503於其側面具有貫通外壁503而與凹部505連通之貫通孔506。第2支撐台500係以可將抽吸泵(未作圖式)與該貫通孔506連結之方式構成。因此，藉由使該抽吸泵運作，而可使凹部505內減壓。
    再者，作為第2支撐台500之構成材料，例如可列舉與作為第1支撐台400之構成材料所列舉者相同的構成材料。
    由如上所述之各構件所構成之純化裝置1可採用如下兩種使用方法：如圖3(a)所示般於第2支撐台500之凹部505內插入微孔板200而使用之第1使用方法、與如圖3(b)所示般於第2支撐台500之凹部505內插入塔板300而使用之第2使用方法，以下說明該等使用方法。
    首先，於第1使用方法中，於第1支撐台400之凹部405內插入多孔過濾板100，進而於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及微孔板200，於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400(參照圖2、圖3(a))。
    藉此，將多孔過濾板100插入至凹部405內，將微孔板200插入至凹部505內。又，將微孔板200之孔形成部202插入至第1支撐台400之開口部402內，進而將第2支撐台500之突出部502插入至第1支撐台400之凹部406內。結果於與多孔過濾板100之各孔101對應地配置有微孔板200之各孔201的狀態下，將第1支撐台400固定於第2支撐台500上。
    又，於該狀態下，藉由墊圈507而禁止於支撐台400、500彼此間之內部與外部之連通(被阻斷)。又，藉由墊圈407而禁止於第1支撐台400與多孔過濾板100之間之連通(被阻斷)。因此，可使由多孔過濾板100、第1支撐台400、及第2支撐台500所形成之內部空間成為對外部封閉之封閉空間。
    因此，藉由使與貫通孔506連結之抽吸泵運作，而使凹部505內減壓，可使上述封閉空間相對於其外部而成為負壓。因此，於多孔過濾板100之孔101內，經由過濾器105，於其上下產生壓力差，故而基於該壓力差，孔101內之液體透過該過濾器105。因此，可使液體自各孔101經由貫通孔104而流出，結果將液體選擇性地供給至與該等孔101對應之微孔板200之孔201內。
    其次，於第2使用方法中，於第1支撐台400之凹部405內插入多孔過濾板100，進而於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及塔板300，於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400(參照圖2、圖3(b))。
    於第2使用方法中，於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及塔板300，除此以外，與第1使用方法相同。
    藉由上述第2使用方法，亦可使由多孔過濾板100、第1支撐台400、及第2支撐台500所形成之內部空間成為對外部封閉之封閉空間。
    因此，藉由與第1使用方法同樣地使與貫通孔506連結之抽吸泵運作，而使凹部505內減壓，可使液體自各孔101經由貫通孔104而流出。結果可將自各孔101流出之液體一併儲留於位於多孔過濾板100下側之塔板300所具有之凹部301內。
    再者，於該第2使用方法中，只要使自各孔101流出之液體一併儲留於凹部301內即可，因此無需使凹部301之開口部與貫通孔104的間距過小。因此，亦可不於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600。
    又，於本實施形態中，純化裝置1係設為如下構成：藉由使多孔過濾板100之各孔101所具有之過濾器105之下側較其上側而成為負壓，從而使液體透過該過濾器105。然而，純化裝置並不限於該構成，亦可為如下構成：藉由使過濾器105之上側較其下側而成為正壓，從而使液體透過該過濾器105。
    使用如上所述之純化裝置(歧管)1，例如以下述方式可自具備醣鏈之醣蛋白純化醣鏈。 <純化方法>
    圖4~7係用以說明自醣蛋白純化醣鏈之本發明之醣鏈之純化方法的縱剖面圖。又，於以下之說明中，將圖4~7中之上側稱為「上」，將下側稱為「下」。
    再者，於以下所示之醣蛋白之純化方法中，對自藉由電泳所分離出之凝膠中之醣蛋白純化醣鏈的情形進行說明。
    於以下所示之醣鏈之純化方法中，包括如下步驟[1]~[8]：步驟[1]，其係獲得保持有醣蛋白之凝膠；步驟[2]，其係藉由醣鏈游離手段對凝膠進行處理而使醣鏈游離；步驟[3]，其係使游離之醣鏈自凝膠中溶出而獲得含有醣鏈之溶液；步驟[4]，其係使含有醣鏈之溶液接觸與醣鏈特異性結合之捕捉載體而將醣鏈捕捉至該捕捉載體上；步驟[5]，其係將除未結合於上述捕捉載體上之醣鏈以外之物質除去；步驟[6]，其係使捕捉載體所具備之官能基失活；步驟[7]，其係使結合於捕捉載體上之醣鏈再游離，並且利用其他化合物對該醣鏈進行標記化；及步驟[8]，其係對經標記化之醣鏈進行純化。
    以下詳細說明各步驟。
    [1]首先，準備含有醣蛋白之試樣，對該試樣實施特定之處理。藉此，獲得保持有醣蛋白之凝膠。
    作為所準備之含有醣蛋白之試樣，並無特別限定，例如可列舉：全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織等生物體試樣。又，亦可使用預先採用特定之方法進行純化之醣蛋白或未經純化之醣蛋白。
    再者，該試樣亦可藉由脫脂、脫鹽、蛋白質區分醣之方法進行預處理。
    繼而，對試樣實施例如SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉改性聚丙烯醯胺凝膠電泳，Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)、或將等電點電泳與SDS-PAGE組合而成之二維電泳等特定之處理。藉此，於凝膠中將試樣所含之醣蛋白分離。
    繼而，使用例如考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)等染色劑對電泳處理後之凝膠進行染色。藉此，可獲得保持有經染色之醣蛋白之凝膠。
    [2]繼而，對具備經染色之醣蛋白的電泳處理後之凝膠中確認條帶，使用刀具等切出該條帶。繼而，利用刀具等將其切成細片，清洗除去染色劑後，採用醣鏈游離方法使醣鏈自保持於凝膠內之醣蛋白游離。
    作為使醣鏈游離之方法，並無特別限定，例如可採用使用N-醣苷酶或O-醣苷酶之醣苷酶處理、肼分解、藉由鹼處理之β脫離等方法。
    再者，於進行N型醣鏈之分析之情形時，作為使醣鏈游離之方法，較佳為使用N-醣苷酶之N-醣苷酶處理。又，亦可於N-醣苷酶處理之前，使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶等對醣蛋白進行蛋白酶處理。
    [3]繼而，取出醣鏈游離處理後之凝膠，使用清洗液沖洗該凝膠。藉由上述處理，使游離之醣鏈自凝膠中溶出至清洗液中。繼而，於清洗液中使凝膠沈澱，獲得上清液後，回收該上清液，藉此獲得含有醣鏈之溶液(第1步驟)。
    作為清洗液，並無特別限定，例如可列舉：水、各種緩衝液、各種有機溶劑等，可使用該等中之1種或組合2種以上使用。
    再者，視需要亦可藉由濃縮該溶液而增大溶液中之醣鏈之含有率。
    又，於上述步驟[1]~[3]中，醣蛋白自含有醣蛋白之試樣的分離及醣鏈自醣蛋白之游離係藉由使醣鏈自藉由實施電泳處理所獲得之凝膠中游離而進行。然而，並不限定於該情形，亦可藉由對上述試樣實施親和層析法處理或離子交換層析法處理而使醣鏈自經純化之醣蛋白游離。進而，於可將自上述試樣純化醣蛋白之操作省略之情形時，亦可直接對上述試樣所含之醣蛋白實施使醣鏈游離之處理。
    [4]繼而，使含有醣鏈之溶液接觸與醣鏈特異性結合之捕捉載體，而將醣鏈捕捉至該捕捉載體上(第2步驟)。
    此處，醣鏈係生物體內物質中唯一具有醛基之物質。即，醣鏈係於水溶液等狀態下環狀之半縮醛型結構與非環狀型之醛型結構平衡地存在的物質。
    相對於此，蛋白質、核酸及脂質等醣鏈以外之生物體內物質中通常不含有醛基。
    由此，只要利用具有與醛基特異性地反應而形成穩定之鍵之官能基的捕捉載體，即可選擇性地僅捕捉醣鏈。
    作為與醛基特異性地反應之官能基，例如較佳為使用醯肼基、氧基胺基、胺基、胺基硫脲基及該等之衍生物，更佳為使用醯肼基或氧基胺基。藉由氧基胺基與醛基之反應所生成之肟鍵、及藉由醯肼基與醛基之反應所生成之腙鍵可利用酸處理等容易地切斷。因此，於將醣鏈捕捉至捕捉載體上後，可容易地將醣鏈自捕捉載體上切離。
    再者，一般而言，生理活性物質之捕捉/承載多使用胺基，但藉由胺基與醛基之反應所生成之鍵(希夫鹼)之鍵結力較弱，因此需使用還原劑等進行二次處理。由此，胺基對於醣鏈之捕捉而言欠佳。
    作為用以捕捉醣鏈之載體，較佳為使用聚合物粒子。進而，該聚合物粒子較佳為至少於表面之一部分具有與醣鏈之醛基特異性地反應之官能基的固體粒子或凝膠粒子。
    若聚合物粒子為固體粒子或凝膠粒子，則將醣鏈捕捉至聚合物粒子上之後，可使用多孔過濾板100所具備之孔101容易地回收該粒子。
    作為構成上述聚合物粒子之聚合物，例如可列舉下述通式(1)所表示者。
    以下，使用聚合物粒子20作為捕捉載體，對將醣鏈捕捉至聚合物粒子20上之方法進行說明。
    [4-1]首先，使聚合物粒子20分散於純水21中，而獲得分散有聚合物粒子之粒子分散液22。
    該聚合物粒子20之形狀並無特別限定，例如較佳為球狀或與其類似之形狀。
    於聚合物粒子20為球狀之情形時，平均粒徑較佳為設定為0.05~1000 μm左右，更佳為設定為0.05~200 μm左右，進而較佳為設定為0.1~200 μm左右，最佳為設定為0.1~100 μm左右。若平均粒徑未達下限值，則存在難以利用離心分離或過濾對聚合物粒子20進行回收之虞。又，若平均粒徑超過上限值，則存在聚合物粒子20與下述試樣溶液之接觸面積變小而使醣鏈捕捉之效率下降之虞。
    [4-2]繼而，如圖4(a)所示，於第1支撐台400之凹部405內插入多孔過濾板100，進而於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及塔板300。於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400。即，於本步驟中，應用純化裝置1之第2使用方法。
    繼而，於該狀態下，將上述步驟[4-1]中預先製備之粒子分散液22供給至多孔過濾板100所具備之各孔101內後，使純化裝置1之抽吸泵運作。藉此，使由多孔過濾板100、第1支撐台400、及第2支撐台500所形成之內部空間成為負壓，而抽吸各孔101內之粒子分散液22(參照圖4(b))。
    此時，於各孔101中，粒子分散液22中之純水21透過各過濾器105。相對於此，藉由各過濾器105之細孔徑與聚合物粒子20之粒徑的關係，聚合物粒子20無法透過各過濾器105。因此，透過各過濾器105之純水21經由貫通孔104而選擇性地供給至位於多孔過濾板100之下側之塔板300內。
    結果如圖4(c)所示，聚合物粒子20單獨地殘留於多孔過濾板100之各孔101內。
    [4-3]繼而，如圖4(d)所示，將上述步驟[3]中所獲得之含有醣鏈之溶液(以下稱為「醣鏈含有液23」)供給至收納有聚合物粒子20之多孔過濾板100之各孔101內。
    [4-4]繼而，藉由加熱醣鏈含有液23而將醣鏈含有液23保持於固定之溫度範圍直至所供給之醣鏈含有液23乾燥為止(參照圖4(e))。
    藉此，使聚合物粒子20與醣鏈含有液23中所含之醣鏈反應而將醣鏈捕捉至聚合物粒子20上。
    此時之反應液(醣鏈含有液23)之pH值較佳為2~9，更佳為2~7，進而較佳為2~6。再者，pH值調整可藉由例如於上述步驟[4-3]後向各孔101內之醣鏈含有液23中添加各種緩衝液或有機溶劑而進行。
    醣鏈捕捉時之反應液之溫度係以較佳為保持於4~100℃左右、更佳為保持於20~90℃左右、進而較佳為保持於30~80℃左右、最佳為保持於40~80℃左右之溫度範圍之方式進行設定。
    又，反應時間、即直至溶液(醣鏈含有液23)乾燥為止之時間於設定為上述溫度範圍之情形時，通常設定為0.1~3小時左右，較佳為設定為0.6~2小時左右。
    藉由於該條件下使聚合物粒子20與醣鏈反應，而確實地將醣鏈捕捉至聚合物粒子20上。
    再者，如本實施形態般，藉由加熱醣鏈含有液23直至醣鏈含有液23乾燥，可確實地實現聚合物粒子20與醣鏈之反應率之提高。
    再者，作為加熱醣鏈含有液23之方法，並無特別限定，例如可對純化裝置1整體進行加熱，亦可選擇性地對多孔過濾板100進行加熱。
    藉由經過如上所述之步驟[4-1]~[4-4]，而將醣鏈捕捉至聚合物粒子20上。
    再者，於聚合物粒子20為具有醯肼基者之情形時，於醯肼基與醣鏈所具有之還原末端之間進行下述式(2)所示之反應，藉此將醣鏈捕捉至聚合物粒子20上(醣鏈結合於聚合物粒子20上)。
    如上所述般，藉由使用具備多孔過濾板100之純化裝置1，於靜置多孔過濾板100時，可使所供給之液體於各孔101內進行反應。進而，藉由使用純化裝置1對多孔過濾板100進行抽吸，可容易地將供給至各孔101內之液體中所含之固體成分與液態成分加以分離。
    [5]繼而，將除捕捉至捕捉載體上之醣鏈以外之物質除去(第3步驟)。
    此處，於如上所述般使用聚合物粒子20作為捕捉載體之情形時，作為除捕捉至(結合於)聚合物粒子20上之醣鏈以外之物質，例如可列舉未捕捉至(結合於)聚合物粒子20上之醣鏈，除此以外，非特異性地吸附於聚合物粒子20表面上之除醣鏈以外之夾雜物(蛋白質、脂質等)。
    如此，於上述步驟[4]中，於聚合物粒子20上結合有目標醣鏈，與此同時，除該醣鏈以外之物質以吸附等方式承載於聚合物粒子20上。即，獲得具有目標醣鏈及不必要物質之捕捉載體。
    因此，於本步驟[5]中，藉由進行清洗而除去該等物質。
    以下，說明與上述步驟[4]同樣地使用多孔過濾板100所具備之孔101對捕捉至聚合物粒子20上之除醣鏈以外之物質(以下有時亦將該物質稱為「清洗物質」)進行清洗除去的情形。
    [5-1]首先，如圖5(a)所示，對上述步驟[4-4]中所獲得之多孔過濾板100之各孔101中之乾燥聚合物粒子20添加清洗液24。
    作為清洗液24，並無特別限定，可列舉：水、各種緩衝液、各種有機溶劑等，可將該等適當組合而使用。
    [5-2]繼而，將純化裝置1維持為上述步驟[4-2]中所說明之狀態，即，應用純化裝置1之第2使用方法，使純化裝置1之抽吸泵運作。藉此，使由多孔過濾板100、第1支撐台400、及第2支撐台500所形成之內部空間成為負壓，而抽吸各孔101內之清洗液24(參照圖5(b))。
    結果使清洗液24透過各過濾器105。藉此，如圖5(c)所示，可於使聚合物粒子20殘留於多孔過濾板100內之狀態下，由多孔過濾板100選擇性地將清洗液24除去至塔板300內。因此，亦可將溶解於清洗液24中之清洗物質除去。
    藉由進行複數次(反覆)由該等步驟[5-1]及步驟[5-2]所構成之清洗操作，而可於使清洗物質溶解於清洗液24中之狀態下將清洗物質分離至塔板300內。因此，可確實地將清洗物質自捕捉有醣鏈之聚合物粒子20上除去。
    即，於步驟[5-1]及步驟[5-2]中，使用具備複數個具備過濾器105之孔101的多孔過濾板100，對各孔101中之聚合物粒子20供給將除結合於聚合物粒子20上之醣鏈以外之物質除去的清洗液24後，藉由使各過濾器105之下側成為負壓而於各孔101之上下產生壓力差。結果藉由各過濾器105將清洗液24與聚合物粒子20分離。
    再者，於該情形時，較佳為首先使用水或緩衝液作為清洗液24而充分地清洗聚合物粒子20後，進而利用有機溶劑之清洗液24清洗聚合物粒子20，視需要利用該等清洗液24反覆進行清洗，最後利用有機溶劑之清洗液24清洗聚合物粒子20。藉此，可更確實地除去清洗物質、尤其是非特異性地吸附於聚合物粒子20表面上之夾雜物。
    [6]繼而，使捕捉載體所具備之官能基失活。
    於本步驟中，於上述步驟[4]中，使未被用於捕捉醣鏈之捕捉載體所具備的官能基(與醣鏈之醛基特異性地反應之官能基)失活。
    藉此，於下一步驟[7]中，於使結合於捕捉載體(聚合物粒子20)上之醣鏈再游離時，可確實地防止該醣鏈被再次捕捉至捕捉載體上。
    捕捉載體所具備之官能基之失活例如可藉由使具有使上述官能基失活之功能之失活液接觸捕捉載體而進行。
    又，上述失活液與捕捉載體之接觸只要以使用失活液代替由上述步驟[5-1]及上述步驟[5-2]所構成之清洗操作中之清洗液24而實施上述步驟[5-1]及上述步驟[5-2]的方式進行即可。
    進而，作為失活液，並無特別限定，於官能基為醯肼基之情形時，例如可列舉：乙酸酐、琥珀酸酐等酸酐。藉此，可容易地使官能基失活。
    [7]繼而，使結合於捕捉載體上之醣鏈再游離，並且利用其他化合物(以下有時亦稱為「化合物A」)置換該醣鏈(第4步驟)。即，利用化合物A對醣鏈進行標記化。
    再者，作為該化合物A，較佳為使用具備螢光物質、吸光物質及放射性物質等標記化物質之標記化試劑。
    以下，對與上述步驟[4]、[5]同樣地使用多孔過濾板100所具備之孔101並利用化合物A對醣鏈進行標記化的情形進行說明。
    [7-1]首先，如圖5(d)所示，將含有化合物A之化合物含有液25添加於收納有捕捉有醣鏈之聚合物粒子20的多孔過濾板100之各孔101內。
    向多孔過濾板100之各孔101內所添加之化合物A之添加量相對於捕捉有醣鏈之聚合物粒子20，較佳為成為過量。藉此，可實現下一步驟[7-2]中之化合物A對醣鏈之置換率之提高。
    具體而言，化合物A之添加量相對於聚合物粒子20所具有之與醣鏈特異性地反應的官能基量，較佳為設定為1.5倍量以上，更佳為設定為3倍量以上，進而較佳為設定為5倍量以上，最佳為設定為10倍量以上。
    [7-2]繼而，藉由加熱化合物含有液25而將化合物含有液25保持於固定之溫度範圍直至所添加之化合物含有液25乾燥為止(參照圖5(e))。
    藉此，將所捕捉之醣鏈自聚合物粒子20上切離，大致與此同時，化合物A加成於醣鏈上。因此，醣鏈經化合物A標記化。
    此時之反應液(化合物含有液25)之pH值較佳為2~9，更佳為2~7，進而較佳為2~6。再者，pH值調整可藉由例如於上述步驟[7-1]之後向各孔101內之化合物含有液25中添加各種緩衝液而進行。
    標記化時之反應液之溫度係以較佳為保持於4~100℃左右、更佳為保持於20~90℃左右、進而較佳為保持於30~80℃左右、最佳為保持於40~80℃左右之溫度範圍的方式進行設定。
    又，反應時間、即直至溶液(化合物含有液25)乾燥為止之時間於設定為上述溫度範圍之情形時，通常設定為0.1~3小時左右，較佳為設定為0.6~2小時左右。
    藉由於上述條件下進行標記化，而利用化合物A將醣鏈確實地標記化。
    再者，如本實施形態般，藉由加熱化合物含有液25直至化合物含有液25乾燥，可確實地實現醣鏈與化合物A之反應率之提高。
    藉由經過如上所述之步驟[7-1]、[7-2]，利用化合物A將醣鏈標記化。
    再者，作為化合物A，較佳為使用具有胺氧基或醯肼基之化合物。於聚合物粒子20為具有醯肼基者之情形時，作為化合物A，尤佳為使用下述化學式(3)所表示之N-胺氧基乙酸-色胺醯(精胺酸甲酯)。
    又，作為該化合物A，除上述化合物以外，亦可使用由芳香族胺所構成之螢光物質。
    於使用上述芳香族胺作為化合物A之情形時，所捕捉之醣鏈首先自聚合物粒子20切離而再游離後，經化合物A標記化。
    以下，對使用芳香族胺作為化合物A而利用化合物A對醣鏈進行標記化之情形進行說明。
    [7-1']首先，將使醣鏈再游離之醣鏈游離液添加於收納有捕捉有醣鏈之聚合物粒子20的多孔過濾板100之各孔101內。
    [7-2']繼而，藉由加熱醣鏈游離液而將醣鏈游離液保持於固定之溫度範圍直至所添加之醣鏈游離液乾燥為止。
    藉此，將所捕捉之醣鏈自聚合物粒子20上切離，而使醣鏈再游離。
    此時之反應液(醣鏈游離液)之pH值較佳為2~9，更佳為2~7，進而較佳為2~6。該pH值調整係藉由於上述步驟[7-1']中向各孔101內添加醣鏈游離液而進行，各種緩衝液係用作醣鏈游離液。
    醣鏈游離時之反應液之溫度係以較佳為保持於4~100℃左右、更佳為保持於25~90℃左右、進而較佳為保持於30~80℃左右、最佳為保持於60~80℃左右之溫度範圍的方式進行設定。
    又，反應時間、即直至溶液(醣鏈游離液)乾燥為止之時間於設定為上述溫度範圍之情形時，通常設定為0.1~3小時左右，較佳為設定為0.6~2小時左右。
    藉由於上述條件下進行醣鏈之再游離，而使醣鏈確實地自聚合物粒子20上切離。
    再者，如本實施形態般，藉由加熱醣鏈游離液直至醣鏈游離液乾燥，可確實地實現醣鏈之游離率之提高。
    [7-3']繼而，將含有芳香族胺作為化合物A之化合物含有液25添加於收納有聚合物粒子20與自該聚合物粒子20游離之醣鏈的多孔過濾板100之各孔101內。
    作為芳香族胺(化合物A)，並無特別限定，例如可列舉：2-胺基苯甲醯胺、2-胺基苯甲酸、8-胺基芘-1,3,6-三磺酸鹽、8-胺基萘-1,3,6-三磺酸鹽、2-胺基-9(10H)-吖啶酮、5-胺基螢光素、丹磺醯乙二胺、7-胺基-4-甲基香豆素、3-胺基苯甲酸、7-胺基-1-萘酚及3-(乙醯胺基)-6-胺基吖啶等。其中，較佳為2-胺基苯甲醯胺或2-胺基苯甲酸。就試劑之取得、反應之簡便性而言較佳為使用該等化合物。
    又，於使用2-胺基苯甲醯胺或2-胺基苯甲酸作為芳香族胺之情形時，於通常之條件下，該等係使用0.35 mol/L。然而，於本步驟中，添加化合物含有液25後之各孔101內之溶液、即包含再游離之醣鏈之溶液中的芳香族胺之濃度較佳為設定為0.5 mol/L以上，更佳為設定為1.4 mol/L以上。藉此，可提高利用化合物A對醣鏈之標記效率。然而，若芳香族胺之濃度成為3 mol/L以上，則於其後步驟[8]中，存在難以除去未用於反應之芳香族胺(化合物A)之虞。因此，芳香族胺之濃度最佳為設定為1.4 mol/L以上且3 mol/L以下。
    又，關於化合物含有液25之液量，於以各孔101內所收納之聚合物粒子20為基準規定化合物含有液25之液量之情形時，其液量通常為浸沒聚合物粒子20之程度之液量，例如相對於5 mg之聚合物粒子20，設定為50 μL左右。然而，於本實施形態中，較佳為將化合物含有液25之液量(體積)設定為兩倍量之100 μL左右。藉此，可提高利用化合物A對醣鏈之標記效率。然而，雖然液量亦可超過100 μL，但若超過一定量，則於其後步驟[8]中，存在難以將未被用於醣鏈之標記化反應之芳香族胺(化合物A)除去之虞。因此，液量最佳為設定為100 μL~200 μL之間。
    更具體而言，於使用2-胺基苯甲醯胺作為芳香族胺之情形時，於各孔101內添加以成為1.4 M之2-胺基苯甲醯胺、1 M之氰基硼氫化鈉之濃度之方式溶解於30%乙酸/二甲基亞碸(DMSO，Dimethyl Sulfoxide)中而成之溶液100 μL作為化合物含有液25。
    [7-4']繼而，藉由加熱化合物含有液25而將化合物含有液25保持於固定之溫度範圍。
    藉此，自聚合物粒子20再游離之醣鏈與化合物A反應，結果醣鏈經化合物A標記化。
    此時之反應液(化合物含有液25)之pH值較佳為2~9，更佳為2~7，進而較佳為2~6。
    標記化時之反應液之溫度係以較佳為保持於0~100℃左右、更佳為保持於4~95℃左右、進而較佳為保持於30~90℃左右之溫度範圍的方式進行設定。
    又，反應時間於設定為上述溫度範圍之情形時，通常設定為0.1~20小時左右，較佳為設定為0.6~12小時左右。
    更具體而言，於使用2-胺基苯甲醯胺作為芳香族胺之情形時，於30~70℃之溫度範圍內加熱反應液(化合物含有液25)1~10小時左右而進行反應。
    藉由於上述條件下進行標記化，而利用化合物A將醣鏈確實地標記化。
    再者，於使用芳香族胺作為化合物A之情形時，可省略如上述步驟[7-2]中所說明之化合物含有液25之乾燥。
    藉由如上所述之步驟[7-1']~[7-4']，亦可利用化合物A將醣鏈標記化。
    如此，藉由於使醣鏈自捕捉載體再游離後利用化合物A(標記化試劑)對醣鏈進行標記化，可進一步提高利用化合物A之對醣鏈之標記效率。
    進而，於本步驟中，於無需醣鏈之標記化之情形時，可省略利用化合物A對醣鏈之置換。
    [8]繼而，對利用化合物A進行標記化之醣鏈(以下有時亦稱為「標記化醣鏈」)進行純化(第5步驟)。
    此處，於如上所述般藉由使捕捉至聚合物粒子20上之醣鏈再游離而獲得標記化醣鏈之情形時，作為多孔過濾板100之各孔101中所含之物質，除利用化合物A進行標記化之醣鏈以外，亦可列舉：醣鏈游離之聚合物粒子20及未被用於醣鏈之標記化之化合物A(以下有時亦稱為「未使用化合物A」)。
    因此，於本步驟[8]中，藉由將該等聚合物粒子20及未使用化合物A除去而進行標記化醣鏈之純化。
    以下，對與上述步驟[4]~[7]同樣地使用多孔過濾板100所含有之孔101對標記化醣鏈進行純化之情形進行說明。
    [8-1]首先，如圖6(a)所示，將於各孔101中收納有上述步驟[7-2]中所獲得之經乾燥之標記化醣鏈與聚合物粒子20的多孔過濾板100插入第1支撐台400之凹部405內，進而於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及微孔板200。於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400。即，於本步驟中應用純化裝置1之第1使用方法。
    繼而，於該狀態下，於多孔過濾板100所具備之各孔101內添加溶解液26。
    作為溶解液26，只要為可溶解標記化醣鏈之液劑即可，並無特別限定，可列舉：水、各種緩衝液、各種有機溶劑等。
    再者，於即便對上述步驟[7-2]中之化合物含有液25進行加熱亦未使聚合物粒子20乾燥之情形時，可省略本步驟[8-1]中之溶解液26向各孔101內之添加。
    進而，於使用由芳香族胺所構成之螢光物質作為化合物A之情形時，由上述步驟[7-1']~[7-4']所獲得之利用化合物A進行標記化之醣鏈並未乾燥。因此，於該情形時，亦可省略本步驟[8-1]中之溶解液26向各孔101內之添加。
    [8-2]繼而，使純化裝置1之抽吸泵運作。藉此，使由多孔過濾板100、第1支撐台400、及第2支撐台500所形成之內部空間成為負壓，而抽吸各孔101內之溶解液26(參照圖6(b))。
    此時，如圖6(c)所示，溶解液26透過各過濾器105。藉此，聚合物粒子20殘留於多孔過濾板100之各孔101內。另一方面，溶解液26自多孔過濾板100之各孔101選擇性地儲留至處於與各孔101對應之位置上之微孔板200所含有之各孔201內。因此，溶解於該溶解液26中之標記化醣鏈亦移動至微孔板200之各孔201內。結果使標記化醣鏈與聚合物粒子20分離。
    即，於步驟[8-2]中，使用具有複數個具備過濾器105之孔101的多孔過濾板100，將溶解液26供給至各孔101中後，藉由使各過濾器105之下側成為負壓而於各孔101之上下產生壓力差，結果使標記化醣鏈與聚合物粒子20分離。
    再者，此時，由於未使用化合物A通常亦對溶解液26表現出溶解性，故而於溶解於溶解液26中之狀態下移動至微孔板200之各孔201側。
    再者，於純化裝置1之第1使用方法中，如上所述般，係以可使微孔板200之孔形成部202插入第1支撐台400之開口部402內之方式進行設定。因此，可將孔形成部202之上表面與多孔過濾板100之底面(底部103之下表面)的間距設定為較小。藉此，即便假設通過貫通孔104之溶解液26飛散，亦可將溶解液26高效率地供給至與各孔101對應之微孔板200之各孔201內。
    具體而言，上述間距較佳為設定為10 mm以下，更佳為設定為0.5 mm以上且10 mm以下，進而較佳為設定為0.5 mm以上且3 mm以下。藉由將間距設定於該範圍內，可更顯著地發揮上述效果。
    [8-3]繼而，準備於各孔101之下側配置矽膠106代替過濾器105，且於與各底部103之貫通孔104對應之位置設置有突出部107的多孔過濾板(多孔矽膠板)100'。繼而，將該多孔過濾板100'插入第1支撐台400之凹部405內，進而於第2支撐台500之凹部505內插入調整板600及塔板300，於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400。
    繼而，如圖7(a)所示，利用乙腈等非水溶劑對上述步驟[8-2]中分離至微孔板200之各孔201內之含有標記化醣鏈的溶解液26進行稀釋，將稀釋後之溶解液26供給至多孔過濾板100'之含有矽膠106之各孔101內。
    藉此，如圖7(b)所示，透過各孔101之矽膠106的溶解液26經由貫通孔104而以液滴之形式流向與各孔101對應之塔板300之凹部301內。
    此時，由於利用乙腈等非水溶劑進行稀釋之溶解液26透過各矽膠106，故而溶解液26所含之標記化醣鏈與未使用化合物A吸附於各矽膠上。
    [8-4]繼而，維持圖7(b)之狀態，進而於多孔過濾板100'之各孔101內供給乙腈等非水溶劑，清洗各矽膠106。
    此處，標記化醣鏈於矽膠106上之吸附力高於未使用化合物A。因此，藉由向各孔101內供給非水溶劑對各矽膠106進行清洗，而可將未使用化合物A之至少一部分自矽膠106中除去。
    [8-5]繼而，如圖7(c)所示，於第2支撐台500之凹部505內插入微孔板200代替塔板300，於該狀態下，於第2支撐台500上載置第1支撐台400。
    其後，於多孔過濾板100'內添加水27，使水透過各矽膠106。藉此，如圖7(d)所示，於微孔板200之各孔201內，純化(分離)溶解於水27中之標記化醣鏈。再者，本實施形態中，利用非水溶劑清洗矽膠106而預先自矽膠106中除去未使用化合物A。因此，可確實地防止或抑制未使用化合物A混在(混入)至水27中。
    再者，於本步驟[8-3]~[8-5]中，係使用形成有突出部107之多孔過濾板100'對標記化醣鏈進行純化。然而，藉由省略該突出部107之形成之多孔過濾板100'亦可以與上述相同之方式對標記化醣鏈進行純化。
    進而，於本步驟[8-3]~[8-5]中，係使用孔形成部202之上表面自框部204之上表面突出的微孔板200對標記化醣鏈進行純化。然而，於可使各突出部107插入各孔201之開口部內之情形時，無需使孔形成部202之上表面自框部204之上表面突出。即，藉由形成有孔形成部202之上表面與框部204之上表面接連之連續面(平坦面)的微孔板，亦可以與上述相同之方式對標記化醣鏈進行純化。
    又，亦可使用對標記化醣鏈之吸附力高於對未使用化合物A之吸附力的任一化合物代替矽膠106。作為該化合物，例如可列舉石墨碳等。
    如上所述，於步驟[8-3]~[8-5]中，藉由使用具有複數個具備矽膠106之孔101的多孔過濾板(多孔矽膠板)100'，基於標記化醣鏈於矽膠106上之吸附力與未使用化合物A於矽膠106上之吸附力的差異，使標記化醣鏈自未使用化合物A分離。
    藉由經過如上所述之步驟，使用純化裝置1純化利用化合物A進行標記化之醣鏈。
    再者，於無需使捕捉載體之官能基失活之情形時，亦可省略上述步驟[6]。進而，於無需將未使用化合物A除去之情形時，亦可省略上述步驟[8-3]。
    又，利用化合物A進行標記化之醣鏈可利用以MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，基質輔助雷射脫附/游離-飛行時間-質譜法)為代表之質譜法、進而高效液相層析法(HPLC)等方法進行分析。
    尤其是於利用上述化學式(3)所表示之N-胺氧基乙酸-色胺醯(精胺酸甲酯)對醣鏈進行標記化之情形時，可使用MALDI-TOF MS進行高感度分析。
    藉由上述醣鏈之純化方法，可以簡單之操作且以優異之精度分離純化醣鏈。進而，可一併對供給至複數個孔內之處理液進行處理，因此可藉由一次純化處理對大量醣鏈進行純化。
    以上，基於圖式之實施形態對本發明之醣鏈之純化方法進行說明，但本發明並不限定於該等。
    例如於本發明之醣鏈之純化方法中，視需要亦可追加1個以上之任意目的之步驟。
    又，本發明之醣鏈之純化方法所使用之純化裝置之各部之構成可與可發揮相同功能之任意者進行置換，又，亦可附加任意構成者。
    進而，於上述實施形態中，於純化裝置中，係設為藉由使多孔過濾板之各孔所含有之過濾器之下側較其上側而成為負壓從而使液體透過該過濾器的構成。然而，並不限於該情形，亦可藉由對多孔過濾板所賦予之離心力使液體透過該過濾器。 [產業上之可利用性]
    本發明包括如下步驟：第1步驟，其係準備含有醣鏈之溶液；第2步驟，其係使上述溶液接觸與上述醣鏈特異性結合之捕捉載體，而獲得具有結合於捕捉載體上之上述醣鏈及除該結合之醣鏈以外之物質的上述捕捉載體；第3步驟，其係自上述捕捉載體除去上述物質；第4步驟，其係使結合於上述捕捉載體上之上述醣鏈自上述捕捉載體再游離後，利用標記化試劑將該再游離之醣鏈標記化；及第5步驟，其係將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離而純化；且於上述第3步驟中，使用具有複數個具備過濾器之孔的多孔過濾板，向收納有具有上述醣鏈及上述物質之上述捕捉載體的上述多孔過濾板之上述各孔內供給自上述捕捉載體除去上述物質之清洗液後，使上述各孔之上下產生壓力差，藉此利用上述各過濾器將上述清洗液與上述捕捉載體分離。藉此，可以簡單之操作且大量地以優異之精度對多樣本同時分離純化醣鏈。因此，本發明具有產業上之可利用性。
    1‧‧‧純化裝置
    20‧‧‧聚合物粒子
    21‧‧‧純水
    22‧‧‧粒子分散液
    23‧‧‧醣鏈含有液
    24‧‧‧清洗液
    25‧‧‧化合物含有液
    26‧‧‧溶解液
    27‧‧‧水
    100、100'‧‧‧多孔過濾板
    101‧‧‧孔
    103‧‧‧底面
    104‧‧‧貫通孔
    105‧‧‧過濾器
    106‧‧‧矽膠
    107‧‧‧突出部
    200‧‧‧微孔板
    201‧‧‧孔
    202‧‧‧孔形成部
    203‧‧‧底面
    204‧‧‧框部
    300‧‧‧塔板
    301‧‧‧凹部
    400‧‧‧第1支撐台
    401‧‧‧底部
    402‧‧‧開口部
    403‧‧‧上側外壁
    404‧‧‧下側外壁
    405‧‧‧凹部
    406‧‧‧凹部
    407‧‧‧墊圈
    408‧‧‧開口部
    500‧‧‧第2支撐台
    501‧‧‧底部
    502‧‧‧突出部
    503‧‧‧外壁
    505‧‧‧凹部
    506‧‧‧貫通孔
    507‧‧‧墊圈
    600‧‧‧調整板
    圖1係表示本發明之醣鏈之純化方法所使用之純化裝置之一例的分解立體圖。
    圖2係表示本發明之醣鏈之純化方法所使用之純化裝置之一例的立體圖。
    圖3(a)、(b)係圖2所示之純化裝置之A-A線剖面圖。
    圖4(a)~(e)係用以說明自醣蛋白純化醣鏈之本發明之醣鏈之純化方法的縱剖面圖。
    圖5(a)~(e)係用以說明自醣蛋白純化醣鏈之本發明之醣鏈之純化方法的縱剖面圖。
    圖6(a)~(c)係用以說明自醣蛋白純化醣鏈之本發明之醣鏈之純化方法的縱剖面圖。
    圖7(a)~(d)係用以說明自醣蛋白純化醣鏈之本發明之醣鏈之純化方法的縱剖面圖。
    权利要求:
    Claims (12)
    [1] 一種醣鏈之純化方法，其特徵在於包括如下步驟：第1步驟，其係準備含有醣鏈之溶液；第2步驟，其係使上述溶液接觸與上述醣鏈特異性結合之捕捉載體，而獲得具有結合於捕捉載體上之上述醣鏈及除該結合之醣鏈以外之物質的上述捕捉載體；第3步驟，其係自上述捕捉載體除去上述物質；第4步驟，其係使結合於上述捕捉載體上之上述醣鏈自上述捕捉載體再游離後，利用標記化試劑將該再游離之醣鏈標記化；及第5步驟，其係將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離而純化；並且於上述第3步驟中，使用具有複數個具備過濾器之孔的多孔過濾板，向收納有具有上述醣鏈及上述物質之上述捕捉載體的上述多孔過濾板之上述各孔內供給自上述捕捉載體除去上述物質之清洗液後，使上述各孔之上下產生壓力差，藉此利用上述各過濾器將上述清洗液與上述捕捉載體分離。
    [2] 如請求項1之醣鏈之純化方法，其中於上述第3步驟中，使上述各過濾器之下側成為負壓，藉此使上述清洗液透過至上述各過濾器之下側。
    [3] 如請求項1之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使用上述多孔過濾板，使收納有上述捕捉載體及上述經標記化之醣鏈的上述多孔過濾板之上述各孔之上下產生壓力差，藉此利用上述各過濾器將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離。
    [4] 如請求項3之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使上述各過濾器之下側成為負壓，藉此使上述經標記化之醣鏈透過至上述各過濾器之下側。
    [5] 如請求項4之醣鏈之純化方法，其中於上述多孔過濾板之下側配置具有複數個孔之微孔板，向與上述多孔過濾板之上述各孔對應之上述微孔板之上述各孔內選擇性地供給上述經標記化之醣鏈。
    [6] 如請求項5之醣鏈之純化方法，其中上述多孔過濾板之底面與上述微孔板之上表面的間距為10 mm以下。
    [7] 如請求項1之醣鏈之純化方法，其中上述標記化試劑為由芳香族胺所構成之螢光物質。
    [8] 如請求項7之醣鏈之純化方法，其中上述螢光物質係選自2-胺基苯甲醯胺、2-胺基苯甲酸、8-胺基芘-1,3,6-三磺酸鹽、8-胺基萘-1,3,6-三磺酸鹽、2-胺基-9(10H)-吖啶酮、5-胺基螢光素、丹磺醯乙二胺、7-胺基-4-甲基香豆素、3-胺基苯甲酸、7-胺基-1-萘酚、3-(乙醯胺基)-6-胺基吖啶中之至少1種。
    [9] 如請求項7之醣鏈之純化方法，其中於上述第4步驟中，上述再游離之醣鏈藉由上述標記化試劑之標記化係於至少包含上述再游離之醣鏈及上述螢光物質之溶液中進行，並且該溶液中之上述螢光物質之濃度為0.5 mol/L以上。
    [10] 如請求項1之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，將上述經標記化之醣鏈與上述捕捉載體分離後，進而使上述經標記化之醣鏈自未被用於標記化之上述標記化試劑分離。
    [11] 如請求項10之醣鏈之純化方法，其中於上述第5步驟中，使用具有複數個具備矽膠之孔的多孔矽膠板，於該多孔矽膠板之上述各孔內，基於上述經標記化之醣鏈於上述矽膠上之吸附力與上述標記化試劑於上述矽膠上之吸附力的差異，使上述經標記化之醣鏈自未被用於標記化之上述標記化試劑分離。
    [12] 如請求項1之醣鏈之純化方法，其中上述捕捉載體為具有醯肼基或氧基胺基之聚合物粒子。
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